雙鍊RNA病毒的代表呼腸孤病毒目（Reovirales）以極其廣泛的宿主範圍影響着地球上衆多生物，其宿主類型包括哺乳動物、魚類、鳥類、爬行類、節肢動物、藻類、真菌以及植物。該病毒目中的多種成員，如輪狀病毒和哺乳動物呼腸孤病毒等，可以導緻嚴重的疾病發生，因此受到全世界研究者的廣泛關注。在呼腸孤病毒目的感染過程中，一個典型的特征是形成無膜病毒複制工廠（viroplasm）。這一結構作為病毒複制和組裝的場所，扮演着至關重要的角色。viroplasm不僅可以保護病毒免受宿主防禦系統的識别和攻擊，還促進了病毒基因組的轉錄和翻譯等活動，從而确保病毒的複制和組裝過程得以高效進行。然而，目前對于viroplasm工作的分子機制的了解仍然十分匮乏。值得注意的是，病毒的非結構蛋白通常在viroplasm中發揮了重要的調控作用。這些非結構蛋白不僅調控着viroplasm的形成與功能，還深刻影響着病毒的複制效率與緻病性。因此，深入研究病毒viroplasm中的關鍵非結構蛋白可以揭示該病毒目複制工廠的工作機制，為相關疾病的預防與治療提供重要的科學依據。
研究團隊以呼腸孤病毒目質型多角體病毒（CPV）為研究對象，首先通過間接免疫熒光實驗和蛋白質共表達發現NSP9與viroplasm潛在骨架NSP8存在一定的相互作用，表明NSP9在viroplasm中扮演重要角色。NSP9的C末端為潛在的内在高度無序區域（IDR），這一特征使NSP9在純化過程中表現出顯著的不均一性和較大程度的聚集傾向。通過制備均一、穩定的NSP9核心（NSP9ΔC）樣品，研究團隊獲得了高質量的蛋白質晶體，利用X射線晶體衍射技術，成功解析了1.8 Å 的NSP9ΔC同源二聚體晶體結構。NSP9ΔC二聚體呈現獨特的“烏篷船”（Awning-ship）形态，且具有高度的對稱性。Alphafold3等結構預測未能準确呈現其複雜的局部特征，尤其是其穩定的二聚體界面。基于序列和三維結構的比對沒有發現數據庫中具有顯著結構相似性的蛋白質，但研究團隊發現一種感染植物的呼腸孤病毒（MRCV）的非結構蛋白P9-1與NSP9具有相似的拓撲結構特征。此外，盡管兩者在整體三維結構上并未展現出顯著的相似性，但核心區域的三束α螺旋表現出極高的結構相似度。這一發現提示在呼腸孤病毒目的非結構蛋白中，可能存在一類拓撲結構上高度保守的折疊形式，有可能使它們執行尚未完全了解的共同功能。
進一步的生化實驗中，研究團隊檢測了NSP9ΔC與核酸的相互作用特性。結果顯示随着蛋白濃度的升高，NSP9ΔC具有依次與單鍊核酸形成不同形式複合物的能力，在凝膠遷移實驗中表現為依次出現兩個不同的遷移條帶。然而，當使用雙鍊核酸進行測試時，并未觀察到類似的現象，表明NSP9ΔC該結合模式嚴格依賴于單鍊核酸，體現了其高度的特異性。分析NSP9ΔC二聚體的結構特征發現，NSP9的N端“手臂樣”（Arches）結構可以通過分子間作用力進一步形成類似“雨篷”（Awning）的結構。同時，二聚體的底部也通過大量分子間氫鍵和疏水作用力的緊密協作，形成了一個穩固的“拉鍊樣”（Zipper）二聚界面。這兩個結構特點共同作用，圍繞并構成了一個封閉的、富含正電荷氨基酸的“通道”（Tunnel）。
NSP9ΔC 晶體結構和同源二聚體相互作用界面
分子對接結果顯示，核酸可以結合在該正電荷通道的内部。随後進行的突變實驗進一步證實了這一結構特征的重要性：當删除Arches結構區域的氨基酸時，破環了Awning和Tunnel完整性，導緻NSP9ΔC完全喪失了核酸結合能力。其中，第20位的賴氨酸在核酸結合中發揮了重要作用。這些結果進一步加深了我們對NSP9與核酸相互作用機制的認識。
NSP9ΔC二聚體的正電荷“通道”結構可能是單鍊核酸結合的重要位點
同時，結構信息也可以提供給我們一種合理的蛋白核酸結合模型猜想：由于正電荷氨基酸孔道結構的存在使得NSP9可以潛在的從單鍊核酸的兩端“串入”，從而表現為生化實驗觀察到的在結合單鍊核酸時蛋白濃度依賴性的依次出現不同形式的蛋白-核酸複合物的能力。
由于viroplasm内大量的轉錄翻譯事件的發生，我們嘗試檢測已經被廣泛報道的翻譯調控因子輪狀病毒的NSP3，意外的發現NSP3的單鍊核酸結合模式與本研究發現的NSP9結合模式高度相似，提示我們NSP9可能同樣具有潛在的翻譯調控功能。
綜上，我們使用生物信息學，生物化學和結構生物學等多種手段，解析了常用的研究模型質型多角體病毒NSP9高分辨率晶體結構，發現了一種全新的蛋白-核酸結合模式，為呼腸孤病毒目病毒複制工廠工作機制的理解提供了全新的線索，也為以病毒複制工廠為靶點的呼腸孤病毒目相關藥物研發提供理論基礎和獨特見解。2024年 9月 17日，伟徳国际官网登录入口籍曉雲團隊在國際權威期刊《核酸研究》（Nucleic Acids Research）上發表題為“Crystal structure and nucleic acid binding mode of CPV NSP9: implications for viroplasm in Reovirales”的最新研究成果。伟徳国际官网登录入口博士生王業大和博士後郭航天為論文的共同第一作者，伟徳国际官网登录入口籍曉雲教授為論文的通訊作者。該研究得到了國家自然科學基金，博士後創新基金的資助以及上海同步輻射光源（SSRF）的大力支持，一并緻謝。
原文鍊接：https://academic.oup.com/nar/advance-article/doi/10.1093/nar/gkae803/7759143