真菌二萜糖苷類産物糞殼菌素（sordarin），可以特異性抑制真菌蛋白質合成過程中延伸因子EF-2的活性，但對人體EF-2無作用，是一廣泛研究的抗真菌候選藥物。但sordarin結構上的複雜性使得化學全合成面臨着高投入、低産出的難題；而全面解析sordarin的生物合成途徑，可以為合成生物學法高效低廉的生産sordarin提供堅實的基礎。
近期，我院戈惠明教授、譚仁祥教授團隊的研究完整闡明了從二萜cycloaraneosene到sordarin的生物合成途徑，包括5/8/5環二萜骨架在多個P450的催化下形成關鍵的Diels-Alder（D-A）反應前體，再經一個新型D-A酶SdnG的催化形成了降冰片烯骨架，進一步的氧化和糖基化形成了最終産物，并通過對SdnG晶體結構的分析推測了該酶的催化機制。相關成果近期發表于Angew. Chem. Int. Ed.，并被編輯遴選為Hot Paper。
圖1 Sordarin生物合成BGC、中間體及生物合成路徑推測
通過對sordarin相關研究的前期調研和生物信息學工具在真菌Sordaria araneosa中确證了sordarin的生物合成基因簇BGC-sdn，通過體内的基因敲除、異源表達和代謝中間體結構的鑒定，證實了多個蛋白的功能（圖1）：其中，GGPP合酶SdnC與二萜環化酶SdnA負責了二萜骨架的形成；SdnK、SdnJ和SdnD負責了糖基單元的合成；4個P450氧化酶SdnB、SdnE、SdnF和SdnH在分子骨架的重排過程中發揮着重要的功能，SdnB催化了C8和C9位的連續羟基化形成7，并在後續的過程中再度負責了臨二醇中C-C鍵的斷裂，形成雙醛基産物12；SdnH催化了7的一步去飽和反應，打造了D-A反應中的環戊二烯結構；SdnF負責将12中的C9醛基轉化為羧基，加速了分子内D-A反應産物11的生成；SdnE負責催化一步羟基化以形成産物sordaricin。至此，sordarin的生物合成過程已然完整，但是同源基因簇對比發現了一個保守存在的基因sdnG, 該基因氨基酸序列中含有一個SnoaL_2結構域。從sdnG突變株中鑒定了6個與D-A反應底物類似的開環産物（13-18）（圖1），這些現象都暗示了SdnG在分子内D-A反應中的潛在作用。
為了回答sordarin生物合成途徑中是否包含了一個D-A酶，作者在體外純化了SdnG的可溶性蛋白，并合成了化合物12和19，在體外進行了系列的酶反應實驗。結果（圖2）顯示含雙醛基的化合物12并不是SdnG的底物，而化合物19雖然可以緩慢自發地發生D-A反應，但在SdnG的催化下，可以快速且完全的催化19轉化成降冰片烯産物11。從而，作者利用體外酶學實驗回答了sordarin生物合成過程中分子内D-A反應是一步酶促反應過程。
圖2 D-A酶SdnG的體外功能表征
為了進一步了解SdnG的催化機制，獲得了分辨率為2.70 Å的SdnG晶體結構（圖3A）。基于結構的分析發現其三維結構與NgnD（圖3B）類似，但是卻塑造了處于不同位置的活性中心。随後産物11與SdnG晶體的分子對接的結果顯示（圖3G），化合物11主要被一些疏水殘基包圍，同時羧基部分與K127和H72通過鹽橋相互作用，并與S91通過氫鍵相互作用，而醛基通過氫鍵被R129和Y41鎖定，從而促進D-A反應的發生。随後通過點突變實驗證明了這些氨基酸和SdnG的催化活性密切相關（圖3H）。
圖3 SdnG和NgnD的晶體結構比較以及點突變
綜上所述，該項工作通過體内基因敲除、中間體結構鑒定、生物轉化、異源表達以及體外酶學實驗完整的闡述了sordarin的生物合成的全過程，證明了4個P450氧化酶SdnB、SdnE、SdnF、SdnH在重排過程中發揮的重要功能，值得注意的是，前期課題組鑒定了一個新型D-A酶SdnG，負責催化降冰片烯骨架的生成，進一步擴展了自然界中酶促D-A反應的類别。這一工作，也将為抗真菌化合物sordarin的進一步組合生物合成研究和以微生物為底盤的工程化生産奠定了重大基礎。
伟徳国际官网登录入口的劉雙鶴博士為文章的第一作者，伟徳国际官网登录入口的戈惠明教授、譚仁祥教授和張博副教授為文章的通訊作者。該研究得到了國家重點研發計劃、國家自然基金委傑出青年基金、青年基金及中央高校基本科研業務費等項目的資助。
原文鍊接：https://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1002/anie.202205577
文章題目：Biosynthesis of Sordarin Revealing a Diels-Alderase for the Formation of the Norbornene Skeleton