從線性前體到環形成的大環化過程可以大幅改變分子的三維結構，進而影響其生物功能。硫酯酶（TE）介導的大環化被認為是聚酮和非核糖體肽類生物合成中最典型的大環化策略，另外還有P450、rieske型氧化酶和自由基酶可以催化大環形成，如vancomycin，metacycloprodigiosin和streptide中的大環構建。此外，大自然還會采用一些非常規的方式來構建大環骨架，例如Diels-Alder酶通過環加成反應構建pyrroindomycin中的大環，雙功能氧化酶LkcE催化獨特的酰胺氧化和曼尼希反應構建lankacidin中的大環體系。因此，了解自然如何将無環前體生成大環分子，可以為生物/化學構建功能大環分子提供新的靈感。
Alchivemycin A（AVM，1）是從植物内生放線菌Streptomyces sp. TP-A0867中分離得到的高度氧化的抗菌聚酮化合物，結構複雜，具有17元N雜環、十氫萘環、罕見的2H-四氫-4,6-二氧代-1,2-惡嗪環（TDO）、環氧環及16個手性中心。在前期的研究中，伟徳国际官网登录入口戈惠明教授團隊已經闡明了AVM生物合成過程中涉及六種氧化還原酶的次級代謝網絡，包括獨特的酰胺鍵間的插氧（J. Am. Chem. Soc.2021, 143, 4751−4757.），但對于其大環形成過程仍然是未知的。近期，該團隊繼續對這一大環化過程進行了解析。
Fig. 1 | Macrocyclic reactions involved in natural product biosynthesis.
為了解其環化機制，作者首先對基因簇中剩餘的未确認功能的基因進行敲除，發現avmM與化合物2中的16元大環形成相關。進一步的體外酶催化發現：AvmM可以在不需要任何輔因子情況下迅速将化合物3環化，形成2。化合物3到2的環化過程，涉及羟基的離去及C-N鍵的形成，但反應結果與SN反應不符。重水标記實驗發現C25位羰基α-H被一個D标記，因此推測反應中首先發生β-消除形成雙鍵，随後通過邁克爾加成環化，雖然在反應時間曲線中未捕捉到脫水成雙鍵的中間體。
Fig. 2 | Characterization of AvmM as a macrocyclase.
随後的生物信息學分析發現，無論是一級序列還是三級序列，在數據庫中都未找到任何蛋白與AvmM相似。為進一步了解AvmM的催化過程，通過在蛋白中引入硒代甲硫氨酸确定相位，最終得到了AvmM（2.09 Å）及AvmM-2（2.5 Å）複合晶體結構，發現AvmM以幾乎僅由β折疊組成的同源三聚體形式存在。
Fig. 3 | Crystal structures and point mutations of AvmM.
随後結合晶體結構、分子對接及分子動力學模拟，對蛋白活性位點進行了點突變驗證。同時，在AvmM-L182A的催化中檢測到痕量極不穩定的推測的脫水中間體存在，并最終鑒定其為脫水化合物4。
Fig. 4 | MD and DFT analysis.
不同于經典的PKS脫水步驟：需要組氨酸作為堿奪取羰基的α-H，然後為為β-OH提供質子完成脫水。在分子模拟中發現，底物3的5 Å範圍内，沒有任何氨基酸殘基可以作為堿奪取3中的α-H (H-24)。為了揭示其獨特的反應機理，進一步進行了DFT計算。并根據上述所有結果分析了AvmM的催化機理：關鍵殘基E104和H108可以通過質子中繼由特特拉姆酸部分來奪取質/提供質子以引發脫水反應，随後N進攻β-C (C-23)進行邁克爾加成，烯醇中間态質子化後得到環化的産物2。同時，16元大環的形成可以顯著改變底物3中柔性側鍊的構象，使得側鍊與蛋白殘基的氫鍵相互作用消失，從而利于産物2的釋放完成催化循環。
Fig. 5 | Proposed reaction mechanism for AvmM.
總之，作者通過體内基因敲除、體外生化實驗、晶體學研究、MD模拟及DFT計算，詳細闡釋了AvmM可以通過催化串聯β-消除和邁克爾加成構建16元大環，揭示了天然産物生物合成中的一種新的大環化策略。該研究也将為大環功能分子的酶學或化學構建提供思路。
近期，該項工作以“AvmM catalyses macrocyclization through dehydration/michael-type addition in alchivemycin A biosynthesis”為題，發表在Nature Communications上，伟徳国际官网登录入口朱宏傑博士、張博副教授和化學化工學院魏婉清博士為文章共同第一作者，伟徳国际官网登录入口戈惠明教授、譚仁祥教授和化學化工學院梁勇教授為文章通訊作者。該項研究工作得到國家傑出青年基金、國家重點研發計劃等項目的資助。
原文鍊接：https://www.nature.com/articles/s41467-022-32088-4