β-内酯類化合物是一類含四元内酯結構的分子，在自然界中鮮有報道，由于β-内酯環固有的高張力，使其很容易被蛋白上的親核基團所進攻，從而導緻開環，形成共價鍵，因此，β-内酯是一種理想的藥效基團，可用于開發高效的酶抑制劑。例如，鍊黴菌所産生的β-内酯化合物lipstatin 的是胰腺脂肪酶的強效共價抑制劑，其四氫衍生物orlistat（奧利司他）已被FDA 批準用于治療肥胖症。Salinosporamide A 是一種從海洋鹽孢菌中分離出來的β-内酯化合物，是一種20S 蛋白酶體不可逆共價抑制劑，目前正處于治療多發性骨髓瘤和其他晚期惡性腫瘤的III期臨床試驗中。因此，β-内酯化合物是一類極具吸引力的天然産物，不僅具有獨特的結構特征，還具有潛在的生物活性。
近期，我院戈惠明課題組在《自然-合成》（Nature Synthesis）發表了題為“Discovery and biosynthetic pathway analysis of cyclopentane–β-lactone globilactone A ”的研究論文。該研究從鍊黴菌中通過基因組挖掘發現了一類新型環戊烷-β-内酯化合物，并揭示了其獨特的環戊烷-β-内酯雙環結構的裝配線上形成過程。
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研究人員利用基因組挖掘方法在鍊黴菌Streptomyces globisporus NPDC060234 的基因組中發現了一條PKS/類NRPS雜合的基因簇glo，通過異源表達及發酵分離，從中鑒定了一個包含環戊烷-β-内酯化合物 globilactone A（1）及兩個β-内酯開環衍生物globilactone B（2）和C（3）（圖1）。活性實驗結果顯示化合物1對A類的β-内酰胺酶具有一定的抑制作用，IC50 值為15.05 μM。
根據文獻報道，僅有3例β-内酯類化合物的成環機制被研究清楚：obafluorin，vibralactone和salinosporamide A。Globilactone A中獨特的雙環結構促使研究人員對其生物合成過程展開了研究。通過基因敲除和代謝産物分析，研究人員對其生物合成過程進行了推測，主要包括兩個方面，一個是裝配線上的骨架形成過程，另一個是線下的後修飾過程。根據突變菌株中的代謝産物分離及體外酶反應實驗表明，線下的後修飾過程包括C15位羰基的還原，由短鍊脫氫酶GloE催化；以及C12位的羟基化，由P450蛋白GloF負責。當C15位羰基未被還原時，β-内酯環容易被N-乙酰基-半胱氨酸進攻開環，形成對應的化合物2和3（圖1）。
圖1 globilactone A-C（1-3）生物合成過程推測
首先，作者對線上的骨架形成過程進行了研究，其骨架包括兩部分：一部分是由聚酮合成酶合成的聚酮鍊，另一部分是甘油酸酰基來源的三碳單元。研究人員通過投喂全碳标記的葡萄糖（[13C6]-glucose）進行了驗證，證實該三碳單元來源于糖酵解途徑的1，3-二磷酸甘油酸，經FkbH識别并轉移至PCP進入裝配線。關于兩部分是如何構建的雙環骨架，作者提出了兩條路線，通過投喂C1标記的葡萄糖（[1-13C]-glucose）及産物分離鑒定，表明其成環過程是經路線ii進行的（圖2）。
圖2 a.環戊烷-β-内酯兩種成環路線推測；b.投喂标記葡萄糖及對應分離産物。
為了進一步研究其雙環結構的成環機制，研究人員表達了相關蛋白，并合成了對應的線性聚酮鍊作為底物進行酶反應，成功在體外重構了化合物3的生成（圖3a）。同時，研究人員将合成的标記的甘油酸作為1,3二磷酸甘油酸的前體進行了酶反應，得到了對應的标記産物3c和中間體12’，進一步證實了該反應中間體（圖3d）。
圖3 體外重構globilactone B（3）及LC-MS分析酶反應産物
随後，研究人員通過化學衍生化實驗和蛋白點突變實驗揭示了雙環結構的形成過程，首先是FkbH domain的作用下對三碳單元進行脫水，然後由C domain催化邁可爾加成，形成了第一個碳-碳鍵C10-C16，然後R domain将PCP domain上的硫酯還原成醛基，引發了aldol加成，形成了第二個碳-碳鍵C11-C14，然後反應中間體轉移到酯酶上，由酯酶催化酯化反應形成β-内酯并從蛋白上解離下來生成中間體6，随後進入後修飾過程。
最後，作者以GloC和GloD為探針進行了基因組挖掘，共找到7株含有glo同源基因簇的菌株，通過異源表達，作者發現其中兩株菌可以産生這類化合物，并分離得到了一個新的β-内酯開環産物。
該工作通過體内體外實驗揭示了其PKS和類NRPS 裝配線形成環戊烷-β-内酯的生化機制，表明類NRPS 模塊具有顯著的功能多樣性，豐富了β-内酯的形成策略，為指導未來的基因組挖掘和基于 β-内酯的天然産物的化學酶法合成提供了基礎。
伟徳国际官网登录入口博士後徐梓斐為文章第一作者，伟徳国际官网登录入口戈惠明和譚仁祥教授為通訊作者。該研究得到了國家重點研發計劃、國家自然基金及中央高校基本科研業務費等項目的資助。
原文鍊接：https://www.nature.com/articles/s44160-023-00414-3
文章題目：Discovery and biosynthetic pathway analysis of cyclopentane–β-lactone globilactone A