Phomactin類二萜化合物是于1991年首次從海洋真菌Phoma sp. SANK 11486中分離鑒定出的一系列分子，作為血小闆活化因子（platelet activating factor, PAF）拮抗劑，能夠抑制PAF誘導的血小闆聚集及其與受體的結合。PAF作為一種有效的磷脂介質，能夠參與許多生理和病理過程，如炎症、過敏、心血管疾病和休克等。Phomactin作為PAF拮抗劑可以抑制PAF與其受體的結合并阻斷其下遊信号傳導，因此具有治療PAF介導相關疾病的潛力。
該家族化合物具有獨特的雙環[9.3.1]十五烷骨架，與明星分子verticillene和taxadiene有着驚人的相似之處。此外，碳骨架上還存在着多個立體選擇性的氧化修飾，從而構建多個結構各異的phomactin類天然産物。藉由複雜的結構特征和潛在的成藥價值，該家族天然産物備受合成化學家的關注。截至目前，圍繞phomactin的化學全合成已存在多篇報道。然而，盡管已被發現32年之久，phomactin類天然産物的生物合成機制仍未被闡明。
近期，我院戈惠明課題組在Angew. Chem. Int. Ed.期刊在線發表了針對活性二萜phomactin生物合成的研究。通過生物信息學分析、異源表達等手段，首次闡明phomactin類天然産物的生物合成途徑。此外，利用同位素标記實驗，闡明phomactatriene的重排機制，并結合蛋白晶體結構解析和定點突變實驗，揭示二萜合酶PhmA新穎的金屬離子結合模式和酶學機制。
Figure 1. Biosynthesis of phomactins.
通過生物信息學分析、異源表達等手段，研究者首次從phomactin的産生菌Phoma sp. ATCC 74077中鑒定出phomactin的生物合成基因簇phm。除二萜合酶（PhmA）和香葉基香葉基焦磷酸合酶（PhmB）外，phm基因簇上還編碼了一個細胞色素P450單加氧酶（PhmC）、一個HMG-CoA還原酶（PhmD）、一個短鍊脫氫酶（PhmE）、一個轉運蛋白（PhmF）和三個假設蛋白（PhmG、PhmH和PhmI）（Figure 1A）。結合體内外生化實驗，證實構建多個結構各異的phomactin類天然産物僅需兩個酶的參與，包括催化phomactin萜烯骨架phomactatriene（1）合成的二萜合酶PhmA，以及能夠催化phomactatriene不同位點連續氧化的多功能細胞色素P450單加氧酶PhmC（Figure 1B）。
Figure 2. Cyclization mechanism of 1.
基于phomactatriene獨特的雙環[9.3.1]十五烷骨架，作者設計實驗以闡明phomactatriene的重排機制（Figure 2）。首先，通過[2-13C]乙酸鹽投喂實驗，證實phomactatriene的形成過程中存在一步1,2-甲基遷移過程。随後，結合phomactatriene的結構特征，推測PhmA催化GGPP形成化合物1還需要發生兩步1,2-H−遷移過程。最後，通過化學合成相應底物并表達所需蛋白，利用一鍋酶法分别證實兩步1,2-H−遷移過程。
Figure 3. Crystal structures of PhmA.
與經典的I型萜類合酶相比，PhmA僅具有保守的DDXXD基序，而保守的NSE/DTE基序在PhmA中缺失。此外，PhmA中RY基序相較經典的I型萜類合酶向C端移動了兩個殘基，據此推測其可能具有獨特的酶學機制（Figure. 3C）。通過解析PhmA及其與FGGPP、Mg2+的共晶結構，并結合定點突變實驗，從而證實了PhmA新穎的金屬離子結合模式。除焦磷酸部分外，FGGPP的香葉基香葉基部分主要通過疏水相互作用被非極性基團協同控制。活性口袋中，需要成鍵的C1/C14和C10/C15的距離分别為4.3 Å和3.8 Å，有利于後續環化反應的發生（Figure. 3D）。進一步的定點突變實驗表征了PhmA獨特的酶促機制。
本工作首次揭示了phomactin的生物合成機制，并結合同位素标記實驗、蛋白晶體結構解析和定點突變實驗闡明PhmA新穎的金屬離子結合模式并揭示了其獨特的酶促機制。該工作為合成生物學高效生産phomactin類天然産物奠定基礎，并為其它萜類天然産物的生物合成研究提供新的見解。
伟徳国际官网登录入口博士生張麗為文章的第一作者，伟徳国际官网登录入口戈惠明教授、張博副教授為文章的通訊作者。該研究得到了中華人民共和國科學技術部、國家自然科學基金委員會、江蘇省自然科學基金委員會、中央高校基本科研業務費專項資金、伟徳国际官网登录入口全球戰略合作夥伴推進計劃等項目的資助。
原文鍊接：https://doi.org/10.1002/anie.202312996
文章題目：Biosynthesis of Phomactin Platelet Activating Factor Antagonist Requires a Two-Enzyme Cascade