II型聚酮合酶(PKSs)是一種獨立的單功能酶，它們形成多酶複合物能夠組裝各種生物活性芳香天然産物，如臨床重要的阿黴素、四環素和光神黴素等等。在典型II型PKS體系中，聚酮合酶(KS)和鍊長因子(CLF)形成異源二聚體(KS-CLF)，反複催化多輪脫羧Claisen縮合反應，生成與酰基載體蛋白（ACP）連接的聚酮酰硫酯中間體。全長的聚酮中間體在酮基還原酶(KRs)、環化酶(CYCs)和芳香化酶等輔酶的作用下進行折疊，從而形成芳香化合物。而近年來出現了一類特殊的高度還原的II型聚酮合酶（HR Type II PKSs），其被證實參與了多烯類化合物的生物合成。例如對多烯化合物ishgamide的體外生化研究表明，一個HR Type II PKSs負責了其生物合成。Iga II型PKS系統的核心酶與典型II型PKS系統有很多共同之處，但有額外的KR和脫水酶(DH)。KR和DH可重複催化ACP上底物的β-酮基還原和脫水形成雙鍵，最終經過多次延伸循環後形成多烯化合物。
此外，近幾年有少量含肉桂酰基團的天然産物(CCNPs)被報道，例如skyllamycin, WS9326A, haoxinnamide, pepticinnamin, atratumycin, youssoufene等等均具有抗菌、細胞毒和抗結核活性。肉桂酰基團的生物合成被認為是由一種特殊的高度還原(HR)的II型聚酮合成酶(PKS)催化的（Scheme 1）。然而，其生物合成路線，特别是苯環形成的環化步驟仍不清楚。
在前期的研究中，我們通過基因挖掘發現了一類含有肉桂酰基團的糖肽類化合物kitacinnamycins（Chem. Sci., 2019, 10, 4839-4846.）。鑒于這些CCNPs中特殊肉桂酰基團的生物合成步驟一直未被研究清楚，于是我們以kitacinnamycin為模型化合物嘗試破譯其生物合成路線。在本研究中，我們表達并獲得了kcn基因簇上HR Type II PKS相關的蛋白，在體外成功重構了kitacinnamycin中肉桂酰基團的合成。簡言之，ACP、KS/CLF、KR、DH以乙酰輔酶A和丙二酰輔酶A作為底物，經三輪延伸後合成了C8-三烯化合物；繼而在異構酶的作用下第三個雙鍵發生異構，随後又經曆兩輪延申形成C12-五烯底物；最後三蛋白複合體Kcn17−Kcn18−Kcn19可以催化C12-五烯底物發生6π-電環化并脫氫生成苯環（Figure 1）。
受到Kcn17-Kcn18-Kcn19催化功能的鼓舞，我們考慮是否其他同源蛋白也可以催化苯環的形成。于是表達了化合物pepticinnamin和WS9326A生物合成基因簇上的相關蛋白，且化學合成了可能的多烯底物2和3。将2和3連在相應ACP上作為底物，體外驗證相應的異構酶和三蛋白複合體的功能，均能産生相應的環化産物。因此，我們的結果表明，三種蛋白複合物Pep21-Pep22-Pep23和Cal10-Cal11-Cal12，分别負責pepticinnamin和WS9326A生物合成中肉桂酰部分苯環的形成。（Figure 2）
與這些通過酰胺鍵與氨基酸殘基結合的肉桂酰部分不同，youssoufene是獨特的遊離肉桂酸類。先前有文獻報道youssoufene生物合成過程中的多烯中間體由HR Type II PKS負責催化形成，然而負責苯環形成的酶仍是未知的。我們發現在其生物合成基因簇中并沒有Kcn17-Kcn18-Kcn19的同源蛋白，但是與已報道的ysf基因簇相比，我們的yss基因簇上多了一個僅含有59個氨基酸的小蛋白YssX。敲除yssX後，終産物不再産生，證明YssX與youssoufene的生物合成相關。為驗證YssX的功能，我們在體外重構了youssoufene的生物合成過程，與Kcn17-Kcn18-Kcn19功能類似，YssX催化了苯環的形成。至此我們闡明了youssoufene的完整生物合成路徑。（Figure 3）
了更好地理解苯環形成的反應機理，我們對從多烯S（模拟2-ACP）開始的一系列反應進行了密度泛函理論(DFT)計算，進一步支持了三蛋白複合體Kcn17-19或蛋白YssX在生物合成中的催化作用。（Figure 4）
綜上，在這項工作中，我們在體外重組了肉桂酰基團的生物合成，并将這些發現擴展到了其他的CCNPs，揭示了長期以來在肉桂酰生物合成中苯環形成的奧秘。盡管苯環在自然産物中幾乎無處不在，但其生物合成并不容易，自然界采用了兩種主要的方法合成苯環：（1）莽草酸途徑是芳香族氨基/羟基酸生成的常見途徑，這些芳香族氨基/羟基酸是大多數生物生成苯衍生物的主要來源；（2）另一種途徑是通過PKSs催化活性聚酮骨架發生環化得到。
本研究首次證明了兩個系統發育完全不同的環化酶可以通過多烯前體合成苯環。其中三蛋白複合體催化的環化代表了CCNPs中形成苯環的一種相對常見的策略，因為至少有6個已知的加上207個未鑒定的生物合成基因簇中都包含這種三基因操縱子，而YssX是一種單獨的酶，隻在youssoufene生物合成過程中負責苯環的形成。本研究的結果拓展了我們對芳香環生物合成的認識，為CCNPs的進一步基因組挖掘和組合生物合成奠定了基礎。
伟徳国际官网登录入口的副研究員史淨博士為文章的第一作者，伟徳国际官网登录入口的戈惠明教授、譚仁祥教授和伟徳国际官网登录入口化學化工學院的梁勇教授為文章的通訊作者。該研究得到了國家重點研發計劃、國家自然基金委傑出青年基金、國家自然基金委青年基金及中央高校基本科研業務費等項目的資助。
原文鍊接：https://pubs.acs.org/doi/pdf/10.1021/jacs.2c02855
文章題目：In Vitro Reconstitution of Cinnamoyl Moiety Reveals Two Distinct
Cyclases for Benzene Ring Formation